Rilevamento di Listeria monocytogenes mediante PCR Real Time negli alimenti

Modalità operative

Questa procedura ha lo scopo di definire il percorso analitico per individuare la presenza di materiale genetico appartenente a Listeria monocytogenes mediante  PCR Real Time di tipo qualitativo, in campioni già riscontrati positivi alla presenza di Listeria spp. mediante test microbiologici e biochimici visti nel capitolo precedente.

L’uso di primers specifici permette di identificare Listeria monocytogenes  attraverso l’impiego di primers per il gene mpI o per l’ HLY A ovvero il gene che codifica la listeriolisina, la tossina con potere patogeno prodotta da Listeria.

 - Attrezzature e strumenti

·        cappe biologiche a flusso laminare

·        ultracentrifuga refrigerata

·        Light Cycler 2.0

·        Light Cycler Capping Tool

·        congelatore -20°C +/- 5°C

·        congelatore -80°C

·        pipette monocanale

·        pipette eppendorf da 1,5 ml e 0,5 ml

·        capillari Light Cycler 0,2 ml

·        blocco refrigerante con adattatori per centrifuga

·        puntali con filtro fino a 10 μl, 20 μl, 200 μl e 1000 μl

- Soluzioni e reagenti

·        acqua distillata sterile

·        InstaGene Matrix (BioRad n° cat. 732-6030)

·        LightCycler food proof Listeria monocytogenes Detection Kit    Roche o alternativi

- Procedura

Preparare la master mix “Listeria genere”: per ogni campione, per i controlli positivi e negativi, allestire la miscela di reazione secondo le indicazioni della seguente tabella:

Mix di reazione per Listeria
REAGENTE	CONCENTRAZIONE FINALE	μl x 1 REAZIONE
Acqua distillata sterile per PCR	1X	10 μl
LightCycler® foodproof®  Listeria m. Detection mix	1X	2 μl
LightCycler® foodproof® Listeria  Enzyme Master mix	1X	2 μl
Uracil-DNA Glicosilasi	1X	1 μl
Volume totale		15 μl
Volume campione DNA		5 μl
Volume finale di reazione		20 μl

Tabella 1.

I parametri per la reazione dell’ amplificazione nel termociclizzatore sono quelli della seguente tabella:

Programma per Listeria monocytogenes
FASE	TEMPERATURA	TEMPO
Pre-incubazione	37°C	2 min
Denaturazione iniziale	95°C	10 min
Denaturazione	95°C	0 sec
Annealing	59°C	59 min
Amplificazione	72°C	5 sec
Numero di cicli		45
Raffreddamento	40°C	30 sec

Tabella 2.

Rilevazione del prodotto di amplificazione

Durante e dopo le reazioni di amplificazione i dati, nel nostro casa vengono elaborati dal software LightCycler^® della Roche^®.

- Interpretazione dei risultati

Confrontare i risultati relativi al Controllo Interno di Amplificazione e al campione incognito: nel caso quest’ ultimo risulti negativo per Listeria monocytogenes, il Controllo Interno di Amplificazione deve essere positivo, per escludere gli effetti di eventuali inibizioni o di una mancata o insufficiente estrazione. Nei campioni positivi il Controllo Interno di Amplificazione può essere negativo.

E’ necessario interpretare i risultati secondo la seguente tabella:

Interpretazione dei risultati
Listeria monocytogenes	Controllo di Amplificazione	Risultato
Positivo	Positivo	Positivo
Negativo	Positivo	Vero negativo
Positivo	Negativo	Positivo
Negativo	Negativo	Falso negative

Tabella 3.

- Espressione dei risultati

Ci sono altri metodi e test per la ricerca di Listeria tramite Real Time PCR. Le procedure si diversificano di poco rispetto a questo descritto (detection kit Roche^®) e le accomuna il fatto che per la conferma e/o l’ individuazione  del patogeno si fa sempre alla ricerca del gene che codifica per la tossina listeriolisina che è il HLY A.

Altri metodi sono:

·        iQ-Check™ Real-Time PCR Kits della BioRad

·        duplicα real time Listeria monocytogenes detection kit

·        etc

La positività all’ analisi indica la presenza nel campione testato di materiale genetico appartenente al microrganismo Listeria monocytogenes.

(Anthony Scorzelli)